Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа. РНК

Р. В. ОИМПСОН и В. Д. БИН (R. W. SIMPSON, W. J. BEAN, JR.)
I. ВВЕДЕНИЕ
Эта глава «освящена довольно новому разделу в биологии вируса гриппа, в связи с чем большая часть информации фрагментарна по -своему составу си включает большое число нерешенных вопросов. Основное утверждение, на котором основывается данная глава, состоит в том, что микоовирусы являются вирусами с негативным геномом (Barry, Mahy, 1973), т. е. вирусами, в состав которых обязательно входит РНК-полимераза. Этот фермент транскрибирует с матрицы фрагментированного генома вируса молекулы комплементарной РНК, являющиеся информационными РНК для синтеза вирусных белков. Разделение излагаемого материала на две части, с одной стороны, описание данных об РНК-полимера-зе инфицированных клеток, а с другой —об РНК-полимеразе очищенных вирусных частиц, диктуется просто удобством и не должно быть истолковано как подтверждение той точки зрения, что в этих двух системах функционируют два различных фермента.
II. АКТИВНОСТЬ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ
Впервые РНК-зависимую активность РНК-полимеразы клеток, инфицированных вирусом гриппа, обнаружили Но и Walters (1966) на гомогенизированных хорион-аллантоисных мембранах куриных эмбрионов, зараженных (вирусом гриппа. Актиномицин D ъ отличие от гуанидингидрохлорида ингиби-ровал эту активность. Дальнейшие подтверждения этому -были получены несколькими лабораториями, внимание которых было сосредоточено в основном -на различных требованиях к системе, временных аспектах возникновения фермента и природе получаемых продуктов (Rage et al., 1968; Skehel, Burke, 1968; Ruck et al., 1969; Scholtissek et al., Rott, 1969a). Ранее было сделано интересное наблюдение того, что инфицирование клеток вирусом чумы птиц (FPV) сопровождается отчетливо выраженным влиянием на активность полимеразы клетки-хозяина (Borland, Mahy, 1968). В этой и ряде последующих работ (Mahy, 1970; Mahy et al., 1972, 1974) изучали активность полимеразы как в ядрышках (полимераза I), так и в иуклеоп-лазме (полимераза II), обнаруживаемую во фракции очищенных ядер, изолированных из инфицированных клеток фибробластов куриных эмбрионов. Активность поли-мераз различалась чувствительностью как -к ионному составу среды, так и ж действию а-аманитина. Было показано, что .активность, нечувствительная к действию -а-аманитина (полимераза I), снижается после инфицирования вирусом, в то время как чувствительная к этому агенту полимераза II, которая, по-видимому, ответственна за синтез клеточных информационных РНК (Roeder, Rutter, 1970; Zyller, Penman, 1971; Roeder, Roeder, 1972), увеличивает свою активность до величины, на 70% большей, чем активность полимеразы в невнфицированных клетках (Mahy et al., 1974). Увеличение активности полимеразы II в изолированных ядрах соответствует первому из двух хорошо различимых периодов увеличения синтеза РНК в инфицированных -клетках, наблюдаемых с помощью метода пульсовой радиоактивной метки через .90 мин и 3 ч после начала инфекции. Только первый из этих двух подъемов активности был чувствителен к а-аманитину, введенному за 1 ч до пульсовой метки. Поскольку известно, что а-аманитин блокирует репликацию вируса гриппа (Rott, Scholtissek, 1970, Mahy et al., 1972), и поскольку соблюдаются условия для осуществления активности ДНК (см. гл. VIII), приведенные выше данные говорят, вероятно, в пользу гипотезы о том, что один (или .больше) вид мРНК клетки-хозяина необходим для репликации на ранних этапах репродукции вируса гриппа.
А. АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В РАЗЛИЧНЫХ ФРАКЦИЯХ КЛЕТОК И ТРЕБОВАНИЯ К ТЕСТ-СИСТЕМЕ IN VITRO
Результаты различных исследований, посвященных изучению природы вирусиндуцированной активности полимеразы в клетках, -инфицированных вирусом гриппа в основном сходны. В -большинстве работ активность полимеразы обнаруживается в микросомальных фракциях спустя 1—2 ч после начала инфекции (Но, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Кроме того, во всех случаях активность фермента является РНК-зависимой, происходит на эндогенной матрице (Schwarz, Scholtissek, 1973) и нечувствительна к действию экзогенной РНК, дезоксирибонуклеазы или акти-номицина D (табл. Г5).
Вирус-специфическая- активность РНК-полимеразы, ассоциированная с инфицированными клетками, с достоверностью была обнаружена в 'Изолированных клеточных фракциях, включающих микросомальные элементы ядра, и не обнаруживалась в клеточном саке, обычно представляющем собой супернатант гомогената клеток после его ультрацентрифугирования (Scholtissek, Rott, 1969a).
Общими в реакции полимеразы in vitro, 'катализируемой клеточным ферментом, являются потребность во всех четырех нуклеозидтрифосфатах (Ruck et al., 1969), температурный оптимум при 28 °С (Paffenholz, Scholtissek, 1973) и линейная кинетика реакции в течение по крайней мере первых 2 часов-инкубации. Необходимо отметить, что, поскольку реакция in vitro поддерживается в течение максимального периода при 28 °С, инкубация реакционной смеси при более высоких температурах (т. е. при условиях, приближающихся к оптимальным условиям для 'вирусной репликации in vivo) приводит к более высокой скорости синтеза РНК с последующим резким спадом активности ,в период между 30 -и 60 мин после' заражения (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Указанный эффект может быть связан с нестабильностью ферментсубстратного комплекса при более высокой, чем оптимальная, температуре реакции in vitro (этот 'вопрос будет обсужден далее для вирионной полимеразы вируса гриппа).
В литературе все еще имеются противоречивые точки зрения на зависимость реакции in vitro, катализируемой ферментом клетки или вириона, от (присутствия различных катионов.. Имеются сообщения о 'Необходимости наличия в реакционной среде Мп2+ и iMg2+ или одного из этих ионов. Различные выводы в этом случае, вероятно, объясняются разницей в выборе системы вирус—клетка, использованного метода очистки, а также действительной концентрацией ионов, присутствующих в реакционной смеси. В табл. 16 сведены результаты, полученные при изучении влияния ионов ,на работу лолиме-разы клетки. Недавно Horrisberger и соавт. (Horrisberger, Guskey, 1974; Horrisberger, Schulze, 1975) показали, что in vitro активность РНК-полимеразы может быть обнаружена в митохондриальной супернатальной фракции лизата клеток, инфицированных вирусом гриппа штамма A0/NWS при наличии в реакционной смеси либо Мп2+, либо Mg2+. Добавление КС! в реакционную среду стимулирует синтез РНК в присутствии Мп2+ и угнетает его в присутствии только Mg2+. Существует несколько объяснений этому явлению, в частности утверждение о присутствии в системе двух ферментов, для работы которых требуется присутствие различных ионов (Horrisberger, Guskey, 1974). Эту точку зрения подтверждает также реакция полимеразы, в присутствии Mg2+, имеющая более высокую начальную скорость и угнетается через 20 мин, в то время как реакция, стимулируемая присутствием только Мп2+, поддерживается по крайней мере в течение 2 ч. Совершенно ясно, что для доказательства обоснованности гипотезы о наличии двух ферментов требуются дальнейшие исследования.
Б. ВЫЯСНЕНИЕ ПРИРОДЫ РНК-ПРОДУКТОВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ IN VITRO С ПОМОЩЬЮ ФРАКЦИЙ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ АКТИВНОСТЬЮ ПОЛИМЕРАЗЫ
Как будет более детально рассмотрено далее (см. гл. 8), инфицирование пермиссивных клеток миксовируса>ми приводит к синтезу в них вирусспецифических РНК, 'представляющих все классы размеров РНК генома очищенного вируса. РНК вирионного типа была обнаружена в основном во фракции РНП как цитоплазмы, так и нуклеоплазмы, в то время -как комплементарные к вирусной РНК молекулы были найдены в минорной фракции РНП цитоплазмы (Pons, 1971; Krug, 1972) и, вероятно, представляют собой, по крайней мере большей частью, молекулы, ассоциированные с полисомами (Nayak, 1970; Pons, 1972). Было обнаружено небольшое количество двунитчатой РНК, также соответствующей всем различным по размерам классам вирионной РНК, но действительная роль этой РНК в биосинтезе вируса еще неизвестна (Pons, 1967; Pons, Hirst, 1968). В отличие от системы in vivo идентификация РНК-продуктов, синтезируемых in vitro с участием фермента клетки, — вопрос открытый. Из нескольких лабораторий (Ruck et al., 1969; Skehel, Burke, 1969; Ma-hy, Bromley, 1969) поступили сообщения о синтезе молекул
10S я 12S РНК, устойчивых к действию рибонуклеазы в реакционных смесях, катализируемых микро-сом альными фракциями инфицированных клеток. Эти молекулы, по мнению некоторых исследователей, представляют собой предшественников однонитчатых форм (Mahy, Bromley, 1969). Гораздо меньше определенности имеется в установлении типа одно-нитчатых РНК, синтезируемых при этих условиях. На основе сравнительного анализа продуктов синтеза, проведенного с помощью использования макросом хорион-аллантоисных мембран инфицированных куриных эмбрионов (штамм А/Ле-нинград/62 (H2N2), Ruck я соавт. (1969) показали, что РНК, синтезируемые in vitro, имеют нуклеотидный состав, сходный с нуклеотидным составом вирионной РНК. Однако, ло данным Scholtissek (1969), от 85 до 100% продукта, синтезируемого в системе in vitro, содержащей микросомальные фракции клеток куриного эмбриона, 'взятых через 6 ч после их заражения вирусом FPV, могли -быть специфически гибрддизо-ваны с гомологичной вирионной РНК. Используя ту же систему вирус—клетка на ранних и поздних этапах инфекции,' Hastie и Mahy (1973) смогли показать, что продукт микросо-мальной РНК-полимеразы, полученной in vitro, содержал от 67 до 93% 1комплементарной РНК в зависимости от момента экстракции из клетки. С помощью соответствующего метода гибридизации эти авторы, кроме того, установили, что очищенные ядра указанных выше клеток in vitro синтезируют вирусную и комплементарную ей РНК приблизительно в равных количествах. Эта ядерная активность полимеразы возникает раньше, чем она обнаруживается в цитоплазматиче-ских фракциях. Описанные данные показывают, что приведенные в литературе противоречивые сведения о различных жлассах однонитчатой РНК, синтезируемой in vitro с помощью фермента, возникающего в клетке в ответ на инфицирование вирусом гриппа, могут объясняться как тем, что клетки отбирали для определения активности полимеразы через различное время после заражения, так и тем, что эта активность изучалась в различных фракциях клеток.
III. АКТИВНОСТЬ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, АССОЦИИРОВАННАЯ С ВИРИОНОМ
Сообщение о наличии у очищенных частиц реовируса РНК-зависимой активности РНК-полимеразы (Shatkin, Sipe, 1968; Borsa, Graham, 1968) последовало вслед за обнаружением вирионной транскреиштазы у рабдовирусов (Baltimore et al., 1970), РНК-содержащих опухолеродных вирусов (Те-min, Mitzutani, 1970; Baltimore, 1970) и парамиксовирусов (Huang et al., 1971). Первые попытки обнаружить такую ферментативную активность у вируса гриппа штамма WSN,
предпринятые в нашей лаборатории, были неудачными, поскольку тест-система in vitro потребовала специального ионного состава среды. Введение в реакционную смесь Мп2+ позволило нам обнаружить -положительную активность РНК-полимеразы у некоторых штаммов вируса гриппа (Chow, Simpson, 1971). Это наблюдение вскоре 'было подтверждено в других лабораториях (Penhoet et al., 1971; Ske-hel, 1971). При сравнении вирионной активности РНК-полимеразы вируса гриппа с активностью лолимеразы других вирусов следует отметить, что транскриптаза вируса гриппа приблизительно в 750 раз менее активна, чем транскриптаза вируса везикулярного стоматита и реовируса соответственно (табл. 17). С другой стороны, вирус гриппа штамма A0/WS приблизительно в 4 и 20 раз более активен, чем вирус болезни Нькжаетла и вирус Сендай. Реовирусы отличаются от других вирусов животных, содержащих вирусную транскриптазу, в отношении как своей высокой активности РНК-полимеразы, так я способности вызывать транскрипцию в системе in vitro (Skehel, Joklik, 1968).
А. ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМЫ IN VITRO
Полный состав реакционной смеси, необходимой для наблюдения активности РНК-полимеразы вярионов гриппа in vitro, в основном сходен с составом, используемым при изучении транекриптазы других оболочечных вирусов животных. Смесь должна содержать вириоиы в очищенном виде, все четыре луклеозидтрифосфата, подходящий детергент (который, по-видимому, необходим для создания доступности комплекса полимераза—рибонуклеопротеид), моновалентные и дивалентные ионы в концентрациях, которые 'будут обсуждены далее. Оптимальная температура непрерывного полиме-разного синтеза РНК в системе in vitro равна 31—33 °С (Bishop et al., 1971a) я отличается от оптимальной температуры для роста вируса в клетках (Scholtissek, Rott, 1969b). Этот эффект, вероятно, связан с нестабильностью комплекса полимераза—матрица в системе in vitro при повышенных температурах.
Влияние различных катионов на синтез РНК-продуктов, осуществляемый с помощью транокрилтазы вирионов в системе in vitro, изучалось несколькими группами исследователей. В своих работах, посвященных этой ферментативной реакции, Chow и Simpson (1971), Penhoet и соавт. (1971) сообщили, что для осуществления активности транскриптазы необходимо присутствие в системе Мп2+. Обе группы исследователей определили минимально необходимую концентрацию этих ионов— 1,9 и 4 мМ соответственно. Если в реакционной оме-си Мп2+ заменить на Mg2+, то синтез РНК проходит на резко сниженном уровне (Chow, Simpson, 1971; Skehel, 1971), хотя наличие ионов Mg2+ в системе и сохраняет высокую активность фермента при концентрации Мп2+ ниже оптимальной (Bishop et al., 1971a). В связи с этими наблюдениями можно сделать вывод, что Мп2+ является двухвалентным катионом, необходимым для функционирования полимеразы вириона гриппа в системе in vitro.
Активность транакриптазы частиц вируса гриппа наряду с ингибированием с помощью удаления из реакционной системы in vitro необходимых для реакции ингредиентов тормозится также рибонуклеазой и полианионами (Chow, Simpson, 1971). Инглбировавие не наблюдается при введении в систему актиномицина D, рифампицина, а-аманитина, ДНК-азы (Chow, Simpson, 1971; Penhoet et al., 1971; Skehel,1971). Однако, как -будет отмечено далее, актиномицин D, по-видимому, подавляет активность транскрипции, обусловленную ферментами вириона, в инфицированных клетках на ранних ее этапах (см. табл. 15). Oxford и соавт., используя вирусную транскриптазную систему in vitro, показали наличие ингибиторного эффекта у селеноцистамина, производных фе-на-нтролена и тиосемикарбазонов, а также всех соединений, которые являются сильными хелатами для «мягких» тяжелых металлов, таких, как цинк (Oxford, 1973a; Oxford, Perrin, 1974). Ингибирование активности фермента, ассоциированного с клеткой, с помощью селеноцистина было описано ранее (Но et al., 1968; Но, Walters, 1971). На то, что вирионная транекриптаза может представлять собой цинксодержащий металлофермент, подобно клеточной РНК- или ДНК-полиме-разе из Е. coli (Scrutton et al., 1971; Slater et al., 1971), указывает присутствие цинка в очищенных частицах вируса гриппа, что было показано с помощью методов атомной аб-сорбции и атомной масс-спектроскошш (Oxford, Perrin, 1975). Важно, кроме того, в этой связи отметить, что цинк входит в состав РНК-зависимой ДНК-полимеразы онкорна-вирусов (Auld et al., 1974). Недавно было также обнаружено стимулирующее влияние на синтез РНК, катализируемый вирионной полимеразой в системе in vitro, хозяйских факторов клеточного происхождения (Rochavansky, персональное сообщение). Один из этих факторов предварительно был идентифицирован как неорганическая пирофосфатаза, поскольку этот фермент в очищенном виде, так же как экстракты нормальных клеток 'куриного эмбриона, стимулировал приблизительно в 2 раза активность РНК-полимеразы вируса гриппа и снимал ингибиторный эффект экзогенного фосфата, добавляемого в реакционную смесь. Идентификация другого фактора клетки-хозяина, который, по-видимому, также стимулирует транскрипцию в системе in vitro, в настоящее время проводится.
Б. ПРОДУКТЫ РЕАКЦИЙ ВИРИОННОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ
Реакция, катализируемая вирионами гриппа, в ранних стадиях линейна и ее скорость пропорциональна количеству вирусного белка, используемого в тест-системе. При экстракции РНК, синтезированной в этих условиях, с помощью фенола с последующей ее обработкой смесью рнбонуклеаз /\ и Ti было обнаружено, что 60—80% продукта лолимеразноп реакции обладают резистентностыо к рибоиуклеазе (Bishop et al., 1971). Большую часть оставшегося РНКазо-чувствительного продукта реакции можно перевести в РИКазо-резнстентную форму с помощью самогибридизации РНК в суммарной тест-системе. Анализ этой РНК с помощью электрофореза в поли-
акриламидном геле при использовании предшественников матрицы и лродуктов реакции, меченных с помощью разных радиоактивных меток, указывает на синтез на ранних этапах РНК, мигрирующих в геле параллельно с ;вирионной матричной РНК, включая все 'Классы размеров и, кроме того, немного .больших по относительной молекулярной массе фрагментов (Bjshop et al., 1971b). Эти последние продукты реакции могут быть превращены (в формы с большей электрофорезной подвижностью ,и с молекулярной массой в пределах 5-Ю4— 3-Ю5 при нагревании РНК до 100°С. Общее заключение о РНК, синтезирующейся вирионной транскриптазой вируса гриппа, которое можно сделать на основе описанных экспериментов, состоит в том, что -большая -часть синтезируемого in vitro продукта представляет собой комплементарную РНК, которая, по-видимому, связана с матрицей с помощью водородных связей с образованием многонитчатых .комплексов еще неясной природы. В настоящее время нет доказательств быстрого вытеснения комплементарных низкомолекулярных цепей из этих комплексов во время процесса транскрипции, как это было показано на модели рабдовирусов, таких, как VSV (Bishop, Roy, 1971).
Инициаторная последовательность РНК-полимеразного продукта в системе in vitro -была определена Hefti и соавт. (1975). Они изолировали рнбонуклеопротеиновый (Компонент из вирионов гриппа штамма WSN и пометили 5'-конец транс-криптазного продукта, синтезированного в системе in vitro, содержащей -у-меченные нуклеозадтрифосфаты. Была найдена в основном только одна инициаторная последовательность — pppGpCp. Несмотря на вывод авторов о том, что транскрипция может начинаться с этой уникальной последовательности, не 'был решен вопрос, каждый ли фрагмент генома вируса гриппа транскрибируется в этой системе. Недавно McGeoch и Kitron (1975) сообщили, что добавление гуано-зина в полимеразную систему стимулирует синтез РНК, комплементарной и вирионной. При условиях реакции, имя использованных, гуанозин включался в б'-конец последовательности GpCp. Стимулирование вирионной транскриптазы было получено также с помощью гуанозин-б'-монофосфата и ди-нуклеотидов GpC и GpG.
В. ВИРИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ТРАНСКРИПТАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ШТАММАХ ВИРУСА ГРИППА
В первом сообщении о наличии в составе частиц вируса гриппа РНК-полимеразы указывалось о штаммовых различиях активности транскриптазы в миксовирусах человека и животных в системе in vitro (Chow, Simpson, 1971). Дальнейшие исследования   (Bean, 1974) привели к выводу, что на
наблюдаемое различие в активности транскриптазы некоторых штаммов вируса гриппа сильно влияет относительная чувствительность    реакции   к температуре    инкубации.   На 23 приведена кинетика реакции в системе in vitro вируса гриппа штамма WS и его дочернего штамма WSN. Эти вирусы отличаются по своим начальным скоростям синтеза как при оптимальной, так и при повышенной (37 °С) температуре. У вируса гриппа штамма WS начальная скорость синтеза всегда выше при 37 °С, а для вируса гриппа штамма WSN наблюдается обратная зависимость. При исследовании вирионной активности полимеразы режомбинантов штаммов WS и WSN было показано, что такие признаки, как предельная скорость реакции и отношение скоростей реакции при двух указанных температурах тест-системы пересортируются в потомстве, являющемся гибридными частицами по другим генетическим маркерам,    совершенно    независимо.    Неизвестно, отражают ли эти свойства системы in vitro    относительную физическую стабильность транскриптазного комплекса в целом или же стабильность его составных частей, в частности РНК-полимеразы. Недавно в нашей лаборатории были исследованы на наличие вирионной активности полимеразы в системе in vitro условно-летальные температуре чувствительные (ts) мутанты вируса гриппа штамма WSN, которые принадлежали к семи различным рекомбинационно-комплементаци-онным группам (Hirst, 1973). Все эти вирусы обладали сниженной активностью ферментов по сравнению с вирусом дикого типа и только один из мутантов (WSNts24) имел активность лишь «а 5% ниже, чем у WSN. Мы не смогли найти корреляции   между необычной   активностью   транскриптазы таких мутантов и их специфическим температурочувствитель-ным дефектом (или дефектами). При исследовании активно-
ста транскриптазы -в вирионах пяти штаммов вируса FPV — представителей различных комллементационных групп — в реакционных смесях при лермисеивных и непермиосивных для роста (вируса температурах (36° л 42 °С соответственно) было показано, что один мутант снизил свою ферментативную активность на 71 %, в то время /как другие вирусы и их родитель дикого типа снизили свою активность при переходе к более высоким температурам лишь на 8—20% (Ghendon et al., 1973). Ни для одного из этих мутантов FPV не было обнаружено ассоциированной с вирусом лолимеразы, которая была бы -нефункциональна в «летках, инкубированных при температурах, исключающих репликацию вируса (для сравнения см. гл. 7). Однако Scholtissek и соавт. (1974) недавно описали ts-мутант FPV, который терял способность вызывать значительный вируоспецифический синтез РНК в клетках, инкубированных при нелермиосивной температуре, несмотря на то что микросомальная РНК-полимеразная активность обнаруживалась в экстрактах этих клеток в реакционных смесях в системе in vitro при температуре 40 °С, когда синтез вируса не имел места. Авторы не смогли объяснить причину наблюдаемого в этом случае несоответствия между функциональной активностью РНК-'Полимеразы вируса гриппа в двух описанных системах.
Доказательство различий в РНК-зависимой РНК-лолиме-разе гетерологичных серотипов вируса гриппа приведено в работе Scholtissek и соавт. (1971). Было показано, что кон-валесцентлая сывороша цыплят, инфицированных FPV, ин-гибировала активность микросомальной РНК-полимеразы, выделенной из клеток, зараженных либо гомологичными, либо гетер о логичными микровирусами А, но не обладала таким свойством при инфицировании клеток вирусом триппа В или парамиксовирусом NDV. Эти данные были рассмотрены как дополнительный аргумент в пользу того, что РНК-полимераза вируса гриппа по крайней мере частично кодируется вирусным геномом. В связи с тем что ранее исследования транскриптазы вируса гриппа проводились в основном на штаммах A, Oxford (1973) недавно провел исследование двух штаммов вируса гриппа В. Эти исследования показали, что вирусы данного типа также могут различаться по активности РНК-полимеразы в системе in vitro.
Г. АКТИВНОСТЬ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В СИСТЕМЕ IN VITRO НЕПОЛНОГО ВИРУСА И СУБВИРУСНЫХ КОМПОНЕНТОВ
Выполненные ранее в других лабораториях исследования продемонстрировали, что неполные или дефектные частицы вируса гриппа (фон-магнусовский тип), продуцируемые в результате нескольких пассажей при высокой множественности
заражения в подходящей хозяйской системе, содержат неполный набор вирионной РНК и обладают сниженной инфек-ционностыо (von Magnus, 1954; Ada, Perry, 1956; Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969). Недавно мы лровели исследование активности РНК-полимеразы препаратов фон-магнусовского вируса гриппа (Bean, 1974; Bean, Simpson, 1975), учитывая, что неполные Т-частицы некоторых рабдовирусов, как было показано ранее, теряли свою транакриптазную активнсгть (Roy, Bishop, 1972; Reichman et al., 1974). Мы обнаружили, что неполные частицы вируса гриппа А (штаммов WS или WSN), которые обладали в 10 000 раз более низкой инфек-ционностыо, чем нормальные частицы, и которые обладали дефицитом, как было установлено ранее Pons и Hirst (1969) и Duesberg (1968), высокомолекулярных фрагментов вирионной РНК, снизили свою транскриптазную активность в системе in vitro по крайней мере в 2 раза. Поскольку ранее было показано, что все классы вирусного нуклеопротеида имеют хорошо выраженную активность РНК-лолимеразы (Bishop et al., 1972), можно ожидать, что неполные частицы вируса гриппа будут тем не менее обладать каталитической активностью в транскрилтазной реакции в системе in vitro, несмотря на свою неполноценность. В связи с этим интересно отметить, что можно лолучить дефектные частицы вируса гриппа, которые, по-видимому, обладают нормальным набором фрагментов РНК, но имеют пониженную в 20 раз инфвкционность (Pons, Hirst, 1969). В нашей лаборатории было показано, что ни максимальное снижение наибольшего по размерам фрагмента вирионной РНК (приблизительно на 2/3), ни некоторое снижение активности лолимеразы в вирионе, вероятно, не являются причиной намного большего по величине уменьшения инфекционности популяции неполного вируса. Все вместе эти факты указывают на то, что сниженная инфекционность этих вирусных частиц объясняется другими, неясными в настоящее время, причинами.
Д. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСНОГО ПОЛИПЕПТИДА, ОТВЕТСТВЕННОГО ЗА АКТИВНОСТЬ ТРАНСКРИПТАЗЫ
В настоящее время остались невыясненными два вопроса, связанных с идентификацией структурного полипелтида (или полипептидов), ответственного за активность транскриптазы вириона, вируса гриппа и механизм взаимодействия этого полипептида с ферментом, ассоциированным с клеткой. В составе белков фракции рибояуклеопротеида диссоциированных вирусных частиц штамма WS, обладающего активностью транскриптазы, находится в основном белок NP (относительная молекулярная масса «^55 000) и следы высокомолекулярного полипептида Р (относительная молекулярная масса си 90 000)   (Bishop et al., 1972). Недавние исследования рибо-
нуклеопротелда, полученного из штамма WSN, подтвердили эти результаты и, кроме того, показали, что компоненты Pi и Р2 высокомолекулярных белков входят в состав фракции, обладающей активностью транскриптазы (Rochovansky, персональное сообщение). Было обнаружено, что как из очищенных частиц вируса гриппа, так и из микросомальной фракции инфицированных вирусом .клеток могут быть изолированы компоненты нуклеокапсида, обладающие активностью полимеразы и идентичные как -морфологически, так и по плавучей плотности. Этот факт является сильным аргументом в пользу того, что описанные ассоциированные с клеткой структуры физически эквивалентны транскрибирующему комплексу, обнаруживаемому в ннтактных вирионах (Compans, Caliguiri, 1973). Хотя вначале было сообщено, что компоненты вирусного нуклеокапеида, обладающие активностью транскриптазы и выделенные из инфицированных вирусом гриппа клеток, содержат только белок NP (Compans, Caliguiri, 1973), те же исследователи позднее обнаружили в аналогичных фракциях полипептид Р. Авторы использовали соответствующую технику радиоактивной метки, необходимую для обнаружения этого белка, который, вероятно, синтезируется на очень ранних этапах инфекционного цикла (Caliguiri, Compans, 1974). До сих пор все попытки отделить мик-росомальную лолимеразу от внутренней матрицы и получить фермент, функционирование которого связано с добавлением экзогенной РНК, были неудачными (Schwarz, Scholtissek, 1973). Отрицательный результат проводимых до настоящего времени попыток изолировать ферментативно-активную по-лимеразу может быть связан с необратимым разрушением самого вирусного фермента или с абсолютной необходимостью присутствия интактного рибонуклеопротеида в качестве функциональной матрицы. Подобным образом методы, .которые с успехом использовали для уничтожения и 'восстановления активности транскриптазы вириона, ассоциированной с нуклеопротеидом рабдовирусов (Bishop et al., 1974), не дали результата при изучении очищенных вирусов гриппа (Bishop, персональное сообщение). В конечном счете идентификации вириояной и клеточной РНК-лолимеразы и выяснению того, насколько для их работы необходимо присутствие матрицы, должно предшествовать успешное осуществление дальнейших попыток выделить эти ферменты в функционально-активном виде.
Е. КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТРАНСКРИПЦИИ ВИРУСА ГРИППА В ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ
Как неинфекционный характер генома вируса гриппа, так и присутствие в составе микоовирусов вирионной РНК-лолимеразы находят свое отражение в том, что первичным собы-
тием, происходящим в клетках, инфицированных вирусом гриппа, является транскрипция вирусной матричной РНК в комплементарную форму (Baltimore, 1971). В нашей лаборатории изучались эти процессы, имеющие место в инфицированных клетках, для того чтобы определить, насколько транскрипция вирионной РНК 'в системе in vivo с точки зрения кинетики реакции и чувствительности ее к действию различных ингибиторов сходна с ее транскрипцией в системе in vitro.
Как сообщили недавно Bean и Simpson (1973), можно проследить превращение меченной по 32Р 'вирионной матричной РНК в устойчивые к действию рибонуклеазы комплексы, которые образуются в результате ее гибридизации с вновь синтезируемыми нитями комплементарной РНК, присутствующей в гибридизационных смесях тотальной РНК, выделяемой через различное время .после инфицирования клеток радиоактивно меченным вирусом гриппа. Этот метод эффективен при наблюдении за синтезом комплементарной РНК в клетках до тех пор, пока через некоторое время после начала инфекции не будут синтезированы такие количества вирионной РНК, что она начнет конкурировать в гибридиза-ционной смеси с вводимой в систему меченой РНК- На 24 представлена кинетика синтеза комплементарной РНК 'в системе in vivo, проанализированная с помощью этого метода. Принципиальной особенностью транскрипции в оистеме in vivo, закономерности которой отражены на рисунке, является ее двухфазный характер. Концентрация продукта транскрипции, который обнаруживается в системе спустя 40—60 мин после начала инфекции, линейно увеличивается до отметки приблизительно 90 мин, затем происходит очень быстрый ее рост. Действие на транскрипцию in vivo таких соединений, как актиномицин D и циклогексимид, интересно в свете нх различного действия и ингибирования синтеза комплементарной и вирусной РНК соответственно (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Актиномицин D, добавленный в систему в момент начала инфекции, полностью ингибирует транскрипцию in vivo, в то время как циклогексимид не влияет на первоначальную (первичную) транскрипцию, но ингибирует ее вторичный подъем (см. 24). Если транскрипцию in vivo проследить в течение более длительного времени, как это показало на 25, то можно заметить, что количество устойчивых к действию рибонуклеазы РНК снижается после 3 ч инкубации.
Это явление мы связали с возникновением в 'клетке конкурирующих молекул вирионной РНК (Bean, Simpson, 1973). Если, однако, циклогексимид добавляли к клеткам после начала усиленной транскрипции, то такого снижения не происходило, вероятно, за счет селективного блокирования этим
соединением синтеза вирионных РНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Наоборот, добавление в систему антиномицинаD через 2 ч после начала инфекции .приводит к резкому спаду содержания устойчивой к действию РНК-азы РНК, возникающей после гибридизации суммарной клеточной РНК. Естественным объяснением этого эффекта является то, что актиномицин D преимущественно ингибирует синтез комплементарной РНК « не действует на образование дополнительной вирионной РНК, которая конкурирует с меченой матричной РНК во время гибридизации. Это объяснение 'было ранее предложено другими исследователями (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). В нашей лаборатории недавно были проведены исследования, посвященные действию других ингибиторов «а процесс транскрипции in vivo. В частности, было обнаружено, что транскрипция вируса гриппа в системе in vivo ингибируетея предварительной обработкой клеток куриных эмбрионов 'кордиеешгаом, а-аманитином, митомицином С, интерфероном и ультрафиолетовым излучением (Bean, Simpson, 1973; Bean, 1974). Очевидная необходимость присутствия
эндогенной функциональной хозяйской ДНК для инициации процесса транскрипции виршонов гриппа в пермиосивных клетках находит отражение в зависящем от дозы подавлении транскрипции in vivo в клетках, облученных до начала инфекции ультрафиолетовой радиацией.
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследования, описанные в этой главе, могут служить стимулом для продолжения работы по изучению РНК-зависимых PiHK-полимераз миксовирусов и выяснению их роли в инфекционном процессе. Вопрос о том, играют ли фрагменты .комплементарной РНК, синтезируемые этим ферментом, непосредственную роль в синтезе вирусных белков, до сих пор не решен (Seigert et al., 1973; Kingsbury, Webster, 1973) н требует дальнейших исследований. Кроме того, в настоящее время еще не проведена химическая идентификация транскриптазы вируса гриппа, и должны 'быть предприняты
героические усилия для изоляции этого фермента в активном виде, чтобы привести его полную характеристику. Вероятно, самый запутанный вопрос, который ждет своего решения, — это вопрос о роли клетки-хозяина в инициации и осуществлении синтеза вир ионных РНК- Хотя актиномицин D и не оказывает заметного действия на активность вир иона и полиме-раз клетки в системе in vitro, это соединение, так же как ультрафиолетовое облучение >и другие ингибиторы активности клеточных ДНК, блокирует транскрипцию -в системе in vivo. Эти факты, а также невозможность обнаружить вирионные продукты в инфицированных 'безъядерных клетках (Follet et al., 1974; Kelley et al., 1974), указывают на то, что для транскрипции вируса гриппа необходимо функционирующее ядро. Однако наличие в системе in vivo первичной транскрипции в присутствии циклогексимида является дополнительным аргументом в пользу того, что для протекания транскрипции не требуется наличия трансляции 'вновь синтезированных мРНК. В настоящее время не выдвинуто какой-либо подходящей гипотезы, которая удовлетворяла бы всем этим запутанным данным. Вместе с большинством исследователей, изучающих эти интересные проблемы, мы надеемся, что можно будет более ясно понять, каким образом транскрипция вируса гриппа регулируется клеточными и вирусными факторами. Эти значения могут сильно помочь нам в разработке эффективных химиотераяевтических подходов для контроля за мвк-совирусной инфекцией человека и животных.
ЛИТЕРАТУРА
Aaslested H. G., Clark H. F., Bishop D. H. L., Koprowski H. J. Virol.. 1971
Ada G. L., Perry В. Т. J. gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Auld D. S., Kawaguchi D. M., Livingston D. M., Vallee B. L. Proc. nat. Acad.
Sci. U. S., 1974, v. 71, p. 2091.
Baltimore D. Nature (London), 1970, v. 226, p. 1209. Baltimore D., Bacteriol. Rev., 1971, v. 35, p. 235. Baltimore D., Huang A. S., Stampfer M. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1970,
v. 66, p. 572. Barry R. D., Mahy B. W. J., eds. Negative Strand Viruses, New York, Acad.
Press, 2975. Bean W. J., Jr. Doctoral Dissertation, Rutgers, The State University of New
Jersey, New Brunswick, 1974.
Bean W. J., Jr., Simpson R. W. Virology, 1973, v. 56, p. 646. Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. virol. Submit, publ., 1975. Bishop D. H. L., Roy P. J. mol. Biol., 1971, v. 57, p. 513. Bishop D. H. L., Obijeski J. F., Simpson R. W. J. Virol., 1971a, v. 8, p. 66. Bishop D. H. L., Obijeski J. F., Simpson R. W. J. Virol, 1971b, v. 8, p. 74. Bishop D. H. L., Roy P., Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. Virol., 1972
Bishop D. H. L, Emerson S. JJ., Flamand A. J. Virol., 1974, v. 14, p. 139. Borland R., Mahy B. W. J. J. Virol, 1968, v. 2, p. 33. Borsa /., Graham A. F. Biochem.    biophys.    Res.    Commun.,    1968